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真菌的DNA和RNA提取要領


http://www.zspupr.live2015-10-13 13:28:45

 

  一、真菌DNA的提取(要領一)

  1.嘗試試劑

  (1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS

  (2)3M NaAc

  (3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA

  (4)酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)

  (5)氯仿:異戊醇(24:1)

  (6)異丙醇

  (7)無水乙醇

  (8)75%乙醇

  (9)RNaseA

  2.嘗試步調

  (1)取真菌菌絲0.5g,在液氮中敏捷研磨成粉

  (2)插手4mL提取液,快速振蕩混勻

  (3)插手等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3~5min(此處是粗提沒有加酚,可以節省本錢)

  (4)1000rpm,4℃,5min

  (5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃離心5min)

  (6)取上清,插手2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,靜置約30 min

  (7)用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇重復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中

  (8)插手1ul RNaseA (10mg/mL),37℃處理賞罰1h

  (9)用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

  (10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上

  (11)沉淀用75%乙醇漂洗,風干,溶于200ul TE中,-20℃生涯備用

  二、真菌DNA的提取(要領二)

  1.真菌菌絲0.5-1g,在液氮中敏捷研磨成粉

  2.插手3mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,時代混勻2-3次

  3.插手1mL 5M KAc,冰浴20min

  4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

  5.取上清,插手2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30 min

  6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇重復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中

  7.插手1ul RNaseA(10mg/mL),37℃處理賞罰1h

  8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

  9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上

  10.沉淀用75%乙醇漂洗,風干,溶于200ul TE中,-20℃生涯備用

  DNA提取緩沖液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇行使前插手5M KAc

  要領一和二,是大同小異.首要是DNA提取液配方紛歧樣!本錢也紛歧樣!

  三、真菌菌絲的總RNA的提取

  1.嘗試試劑

  (1)RNA提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2%聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理賞罰的水設置),25mM EDTA,0.5g/L亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,行使前插手).因為在高溫滅菌前提下,Tris-HCl要和DEPC產生回響,以是配RNA提取緩沖液時直接用DEPC處理賞罰的水配制即可

  (2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA

  (3)10M LiCl直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC留宿后,高溫滅菌

  (4)3M NaAc

  (5)氯仿:異戊醇(24:1)

  (6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)

  (7)DEPC處理賞罰水用1‰的DEPC處理賞罰蒸餾水留宿,高溫滅菌

  (8)無水乙醇;70%酒精

  2.嘗試步調

  (1)嘗試開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中插手ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中插手300ul)

  (2)取約0.8g菌絲體(液體作育得到的菌絲用真空抽濾即可!固體作育就更好說了),在液氮中敏捷磨成風雅粉末,裝入50mL離心管,按1g原料8mL的量插手預熱的RNA提取液,顛倒混勻

  (3)65℃水浴3-10 min,時代混勻2-3次

  (4)插手等體積的酚(留意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

  (5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

  (6)插手1/4V體積10M LiCl溶液,4℃安排6h以上(或留宿)

  (7)10,000rpm,4℃離心20min

  (8)棄上清,用500ul SSTE消融沉淀

  (9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

  (10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

  (11)12,000rpm,4℃離心20 min

  (12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

  (13)加200ul的DEPC處理賞罰水消融

  (14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

  (在抽提進程中,若卵白質含量或其余的雜質還較多,可以增進抽提次數)

  留意:提取RNA請只管在低溫下操縱,假如前提不允許,在室溫下操縱的時刻要盡也許的短.

 

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